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Ionenaustauschchromatographie mit DEAE-Sepharose:

Für den ersten chromatographischen Reinigungsschritt wurde das

Membransolubilisat (siehe vorheriger Abschnitt) auf den schwachen

Anionenaustauscher DEAE Sepharose™ FF aufgetragen. Der Gesamtkomplex

(MtrA-H) wurde bei 306-404 mM NaCl (23-34 % Puffer B.1) eluiert, der Komplex

ohne Untereinheit MtrH (MtrA-G) bei 300-400 mM NaCl (30-40 % Puffer B.2) (siehe

Abbildung 4.2).

Bei der Reinigung des Gesamtkomplexes MtrA-H erhielt man zunächst einige

Fraktionen, die der zur Analyse durchgeführten SDS-Page zufolge zwar den

Komplex, jedoch im Vergleich zu den anderen Untereinheiten nur geringe Mengen

der 34 kDa-Untereinheit MtrH enthielten. Diesen folgten mehrere Fraktionen mit dem

vollständigen, MtrH enthaltenden Komplex. Schließlich nahm der Gehalt an MtrA-H

ab und stattdessen traten diverse Verunreinigungen hinzu (siehe SDS-Page,

Abbildung 4.2).Bei der Vereinigung der Fraktionen galt es einen Kompromiss zu

schließen zwischen der Menge an Gesamtkomplex einerseits und der Reinheit der

Proben andererseits. Die Fraktionen mit geringerem Gehalt an Untereinheit MtrH

wurden bei diesem ersten Reinigungsschritt mit vereinigt, da das Vorliegen eines

Gleichgewichts zwischen dem Gesamtkomplex MtrA-H auf der einen Seite und

Komplex MtrA-G plus lösliche Untereinheit MtrH auf der anderen nicht

ausgeschlossen werden konnte und eine weitere Dissoziation so gering wie möglich

gehalten werden sollte.

Um den Anteil an Fraktionen mit dem vollständigen Komplex MtrA-H zu erhöhen,

wurden auch bei der Ionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sepharose

verschiedene Pufferzusammensetzungen zur Bindung und Elution getestet. Die

pH-Werte wurden ebenfalls zwischen 4,0 und 7,0 sowie der NaCl-Gehalt von Puffer

A.1 zwischen 0 mM und 450 mM variiert. Es zeigte sich jedoch, dass die Versuche

die Bindung von MtrH an den restlichen Komplex MtrA-G kaum veränderten, woraus

geschlossen wurde, dass letztere vor allem von der Membranpräparation abhängig

war.

Bei der säulenchromatographischen Reinigung auf DEAE-Sepharose des

Komplexes MtrA-G ohne Untereinheit MtrH wurden dagegen so gut wie keine

Fraktionen mit MtrH eluiert (siehe Abbildung 4.2) und alle MtrA-G enthaltenden

Faktionen wurden vereinigt.

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