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1 Einleitung

1.5 Ziel der Arbeit

Ziel dieser Arbeit war die strukturelle Charakterisierung der Bindung von H

MPT-

Derivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO

-reduzierenden

Energiestoffwechselweges. Für die N

-Methyl-H

MPT:Coenzym M-Methyltransferase

(Mtr) aus M. marburgensis lag bereits ein Protokoll zur Reinigung unter anaeroben

Bedingungen vor (56). Dieses sollte für die aerobe Reinigung vereinfacht und für die

Erfordernisse der zur Strukturbestimmung verwendeten elektronenmikroskopischen

Einzelpartikelmessung optimiert werden. Dazu wurden zwei Strategien gewählt, zum

einen die Präparation des kompletten, acht Untereinheiten umfassenden Komplexes

MtrA-H, zum anderen die Präparation des Enzymkomplexes MtrA-G unter möglichst

vollständiger Abtrennung der Untereinheit MtrH. Der gereinigte Komplex sollte

sodann elektronenmikroskopisch untersucht werden.

Parallel dazu sollten die den Cob(I)amid-Cofaktor bindende Untereinheit MtrA

sowie die H

MPT-bindende Untereinheit MtrH in für die Kristallisation und

röntgenkristallographische Untersuchung ausreichender Menge und Qualität

gereinigt werden. Hierfür wurden MtrA und MtrH aus M. jannaschii und M. kandleri

bzw. aus M. marburgensis, M. jannaschii und M. kandleri für die heterologe

Expression in E. coli kloniert, die Expressionsbedingungen optimiert und ein

Reinigungsprotokoll etabliert. Anschließend wurden die Untereinheiten

umfangreichen Kristallisationsversuchen unterzogen.

Als zweites H

MPT-bindendes Enzym sollte die F

420

-abhängige N

-Methylen-

MPT-Dehydrogenase (Mtd) aus M. kandleri im Komplex mit Substrat (Methylen-

MPT) und Cosubstrat (F

420

) strukturell charakterisiert werden. Das gereinigte,

rekombinante Enzym wurde mit verschiedenen H

MPT- und F

420

-Derivaten

co-kristallisiert und die Struktur röntgenkristallographisch bestimmt. Anhand dieser

Struktur sollte die Bindung von H

MPT und F

420

analysiert werden.

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