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3 Methoden

Standard zum Größenvergleich wurden 8 µL Prestained Protein Marker, Broad

Range (6–175 kDa) (New England Biolabs, Frankfurt) aufgetragen.

Danach wurden Anoden- und Kathodenraum mit Elektrophoresepuffer

(25 mM TRIS/250 mM Glycin pH 8,3, 0,1 % (w/v) SDS) gefüllt. Die Auftrennung der

Proteine erfolgte bei konstanter Stromstärke (20 mA pro Gel) und

Spannungsbegrenzung auf maximal 200 V bei 4 °C.

Anschließend wurde das Gel aus der Halterung entfernt und 15 min mit heißer

Coomassie-Färbelösung (40 % (v/v) Ethanol, 10 % (v/v) Essigsäure, 0,1 % (w/v)

Coomassie Brilliant Blue R-250) behandelt. Sodann wurde der Hintergrund 30 min

mit heißem Entfärber (40 % (v/v) Ethanol, 10 % (v/v) Essigsäure) entfärbt und die

Gele über Nacht in Wasser gewaschen.

Zur Dokumentation und Aufbewahrung wurden die sorgfältig gewaschenen Gele

auf angefeuchtetes Filterpapier (Whatman

Paper Grade I, Schleicher & Schuell,

Kassel) gelegt und bei 80 °C zwei Stunden unter Vakuum in einer Geltrockenanlage

getrocknet.

3.4.3 Blaue native Polyacrylamidgelelektrophorese (BN-Page)

Zur elektrophoretischen Auftrennung von nativen Proteinen und Protein-

Komplexen wurde die Blaue Native Gelelektrophorese nach Schägger in einer von

Richers für Minigel-Apparaturen a/jointfilesconvert/483107/bgewandelten Form verwendet (116-118).

10 µL Probe wurde mit 10 µL Probenpuffer (50 mM Tricin, 7,5 mM Imidazol,

0,002 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250, 20 % Glycerin) versetzt und in die

Taschen eines 3,5-18 % (w/v) Acrylamid enthaltenden Gradientengels

(3,5-18 % (w/v) Acrylamid, 0,09-0,48 % (w/v) Bisacrylamid, 500 mM

6-Aminocapronsäure, 25 mM Imidazol/HCl pH 7,0, 0-16 % Glycerin, 0,4 % (w/v)

APS, 0,04 % (v/v) TEMED) pipettiert.

Als interner Vergleichsstandard wurden 8 µg BSA und 25 µg Ferritin in 20 µL

Probenpuffer aufgetragen.

Der Anodenraum wurde mit Anodenpuffer (25 mM Imidazol/HCl pH 7,0), der

Kathodenraum mit Kathodenpuffer (50 mM Tricin, 7,5 mM Imidazol, 0,002 % (w/v)

Coomassie Brilliant Blue G-250) gefüllt und zunächst 20 min bei 50 V bzw. 12 mA,

dann 40 min bei 250 V bzw. 12 mA bei 4 °C aufgetrennt.

Die Proteinbanden wurden nach dem Lauf wie im Abschnitt 3.4.2 beschrieben mit

Coomassie Brilliant Blue R-250 gefärbt und dokumentiert.

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