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3 Methoden

Ionenaustauschchromatographie mit Q-Sepharose:

Die vereinigten Fraktionen des vorherigen Abschnitts wurden mit der doppelten

Menge Puffer A.1 (für MtrA-H) bzw. Puffer A.2 (für MtrA-G) versetzt, und auf einem

stärkeren Anionentauscher (HiLoad™ 26/10 Q-Sepharose HP, CV: 53 mL) weiter

gereinigt. Für MtrA-H wurde hierfür ein Gradient von 0-100 % Puffer B.1 über 2 CV,

für MtrA-G von 0-100 % Puffer B.2 über 8 CV gewählt. Die Flussrate betrug

0,7 mL/min. Diejenigen Fraktionen, welche Mtr enthielten, wurden vereinigt.

Gelfiltration:

Die Proben vom vorherigen Abschnitt wurden auf maximal 1 mL eingeengt

(Konzentrator mit MWCO von 100 kDa), durch eine 0,2 µm-Membran filtriert und auf

Superose 6 (16/60-Säule, CV: 120 mL) mit Gelfiltrationspuffer 1 (50 mM MOPS/KOH

pH 7,0, 100 mM NaCl, 10 % (w/v) Glycerin, 2 mM DTT, 0,1 % LM) für MtrA-H und

Gelfiltrationspuffer 2 (50 mM TRIS/HCl pH 7,6, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,1 % LM)

für MtrA-G isokratisch über 1,2 CV mit einer Flussrate von 0,5 mL/min eluiert. Die als

Mtr-haltig identifizierten Proben wurden vereinigt und die Ausbeute mittels Bradford-

Test (siehe Abschnitt 3.4.1) bestimmt.

3.5.3 Reinigung von rekombinantem M. marburgensis MtrH (MMRMtrH)

Die gemäß Abschnitt 3.3.3 kultivierten E. coli-Bakterien wurden in 3 mL

Lysepuffer (50 mM Tris/HCl pH 8,0, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0) pro g

Bakterienfeuchtgewicht resuspendiert und nach Zugabe von 267 µg/mL Lysozym

und 67 µg/mL DNAse I 30 min bei RT inkubiert. Durch Ultraschallbehandlung

(15 min, Puls: 40 %, Leistung: 5 W, 0 °C) wurden die Zellen aufgeschlossen und die

Zellbruchstücke und Einschlusskörperchen abzentrifugiert (43 000 x g, 30 min,

4 °C). Diese wurden anschließend mit 5 ml Waschpuffer (50 mM MOPS/KOH pH 7,0,

100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,005 % LM) gewaschen und erneut zentrifugiert

(43 000 x g, 30 min, 4 °C).

Zur Solubilisierung der Einschlusskörperchen wurden diese in 1 mL

Entfaltungspuffer (50 mM MOPS/KOH pH 7,0, 5 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM

NaCl, 2 mM DTT) aufgenommen und über Nacht unter Rühren bei 4 °C inkubiert.

Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation (43 000 x g, 30 min, 4 °C)

a/jointfilesconvert/483107/bgetrennt.

Der Überstand wurde nun einer Gelfiltration auf Superdex 200 (Superdex 200

16/60 prep grade, CV: 120 mL) unterzogen, wobei mit 1,2 CV Entfaltungspuffer bei

4°C und einer Flussrate von 1 mL/min eluiert wurde. Die durch Absorption bei

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