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3 Methoden

Klon Templat Vorwärts-Primer

(Schnittstelle)

Rückwärts-Primer

(Schnittstelle)

Zielvektoren

MJmtrH genom. DNA

M. jannaschii

MJmtrH+ (NdeI) MJmtrH– (EcoRI) pET22b+,

pACYC-Duet 1

MJmtrA1 genom. DNA

M. jannaschii

MJmtrA+ (NdeI) MJmtrA1– (BamHI) pET22b+

MJmtrA2 genom. DNA

M. jannaschii

MJmtrA+ (NdeI) MJmtrA2– (NcoI) pET22b+

MJmtrA3 genom. DNA

M. jannaschii

MJmtrA+ (NdeI) MJmtrA3– (EcoRI) pET22b+,

pACYC-Duet 1

Ein Reaktionsansatz von 10-50 µL enthielt 0,3-1 µg Templat, 0,2 µM je Primer,

2 U Phusion

High-Fidelity DNA Polymerase, 1x Phusion

HF Reaction Buffer

(Finnzymes, Espoo, Finnland) und 200 µM je dNTP. Die verwendeten

Temperaturprogramme sind in Tabelle 3.3 und 3.4 zu finden. Der Erfolg der PCR-

Reaktionen wurde mittels Agarosegelelektrophorese überprüft.

MJMtrH MJMtrA1

Programmschritt

T/[°C] Zeit/[s] T/[°C] Zeit/[s]

Initiale Denaturierung 98 30 98 60

Denaturierung 98 10 98 60

Primer-Anlagerung 45-56 30 60 60

Kettenverlängerung 72 30

30 Zyklen

72 60

30 Zyklen

Finale Kettensynthese 72 420 72 600

Tabelle 3.2: Übersicht über die durchgeführten PCR-Reaktionen.

Tabelle 3.3: Temperaturprogramme für PCR-Reaktionen von MJMtrH und MJMtrA1.

Tabelle 3.4: Temperaturprogramme für PCR-Reaktionen von MJMtrA2 und MJMtrA3.

MJMtrA2 MJMtrA3

Programmschritt

T/[°C] Zeit/[s] T/[°C] Zeit/[s]

Initiale Denaturierung 98 300 98 180

Denaturierung 98 60 98 30

Primer-Anlagerung 60,5 60 45-65 30

Kettenverlängerung 72 60

30 Zyklen

72 30

34 Zyklen

Finale Kettensynthese 72 600 72 600

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