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5 Diskussion

MJMtrH besitzt deswegen 14 zusätzliche N-terminale Aminosäuren, welche

vermutlich die Faltung des Proteins in E. coli weiter erschwerten.

Zur heterologen Expression von mtrH wurden am Max-Planck-Institut für

terrestrische Mikrobiologie in Marburg bereits zahlreiche Versuche unternommen.

MtrH aus M. marburgensis wurde als Maltosebindeprotein-, Hexahistidin-,

Calmodulin- und Thioredoxinfusionsprotein in E. coli produziert, ferner wurde eine

Co-Expression mit den Chaperonen GroEL und GroES versucht. Darüber hinaus

wurde mit Methanosarcina barkeri ein weiterer Ursprungsorganismus sowie mit

Aspergillus nidulans ein eukaryotisches Expressionssystem für M. marburgensis

mtrH getestet. In allen aufgeführten Experimenten lag MtrH als unlösliches Protein in

Einschlusskörperchen vor oder wurde erst gar nicht in nennenswerten Mengen

produziert (150).

Alle bisher durchgeführten Experimente lassen vermuten, dass der Unterschied

zwischen Archaeen und Bakterien zu groß ist, um eine heterologe Expression von

mtrH zu ermöglichen. Die Isolierung und Reinigung von nativem MtrH aus dem

Ursprungsorganismus oder ein archaeelles Expressionssystem könnten hier Abhilfe

schaffen.

5.3.2 Rekombinantes MtrH (MMRMtrH) aus M. marburgensis

Rekombinant erzeugtes MtrH aus M. marburgensis (MMRMtrH) lag in

Einschlusskörperchen vor, welche zunächst entfaltet, im entfalteten Zustand

gereinigt und schließlich wieder rückgefaltet werden sollten. Während dieser Schritte

war zwar eine Anreicherung von MMRMtrH zu beobachten, jedoch zeigte sich in der

abschließenden Gelfiltration des rückgefalteten Proteins, dass die Probe nicht

monodispers vorlag. Auch traten bei der Analyse mittels SDS-Page zahlreiche

weitere Banden auf, deren Identität nicht geklärt werden konnte. Diese Heterogenität

der Probe ist wahrscheinlich auf die inkorrekte Faltung und partielle Aggregation des

Proteins zurückzuführen. Hinzu kommen vermutlich Abbauprodukte von MMRMtrH,

da entfaltete Proteine besonders anfällig für Proteasen sind.

Da keine Möglichkeit bestand, die korrekte Faltung des Proteins zu überprüfen,

wurden weitere Rückfaltungs- und Reinigungsversuche eingestellt. Als Alternative zu

rekombinantem MtrH wurde bereits im vorhergehenden Abschnitt die Isolierung und

Reinigung des Proteins aus dem Ursprungsorganismus genannt. Dies wurde bereits

für MtrH aus M. marburgensis beschrieben (65). In genanntem Protokoll wurde der

Mtr-Komplex mit LM solubilisiert und MtrH anschließend chromatographisch auf

Q-Sepharose vom Komplex a/jointfilesconvert/483107/bgetrennt. Das Abdissoziieren der Untereinheit MtrH

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