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3 Methoden

3.2.5 Plasmidpräparation

Plasmidpräparationen für analytische Zwecke wurden aus 5 mL LB-Kultur mit

dem QIAprep

Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Anleitung durchgeführt,

wobei mit 50 µL Puffer EB (10 mM TRIS/HCl pH 8,5) eluiert wurde.

Für präparative Zwecke wurde Plasmid aus 100-250 mL LB-Kultur mit dem

HiSpeed

Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden) nach Vorschrift isoliert und mit 1 mL

Plasmidpuffer (10 mM TRIS/HCl pH 8,0) eluiert.

Die Ausbeute der Plasmidpräparationen wurde durch Messung der Absorption

bei 260 nm, die Reinheit durch Verhältnis der Absorptionen bei 260 und 230 nm

sowie 260 und 280 nm ermittelt (siehe Abschnitt 3.2.8).

3.2.6 Agarosegelelektrophorese

Zur Analyse und Präparation von DNA-Fragmenten wurden diese in horizontalen

Agarosegelen (1 % (w/v) in TBE-Puffer (45 mM TRIS, 45 mM Borsäure, 1 mM EDTA

pH 8,0)) mit 1 µg/mL Ethidiumbromid zur Detektion bei UV-Licht elektrophoretisch bei

Raumtemperatur und 90 V bzw. 120 mA getrennt (109). Die Proben wurden vor der

Elektrophorese mit 6x DNA-Probenpuffer (0,25 % Bromphenolblau, 0,25 %

Xylencyanol FF, 15 % Ficoll 400) versetzt, als interner Längenstandard wurden 5 µL

1 kb DNA Ladder (New England Biolabs, Frankfurt) eingesetzt.

3.2.7 Aufreinigung von DNA

Die präparative Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte

mit dem QIAquick

Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben,

wobei mit 30 µL EB-Puffer eluiert wurde.

Zur Abtrennung von kleineren Oligonukleotiden sowie Enzymen z.B. nach der

PCR wurden die DNA-Proben nach Anleitung mit dem QIAquick

PCR Purification

Kit (Qiagen, Hilden) gereinigt, die Elution erfolgte dabei mit 50 µL EB-Puffer.

3.2.8 Bestimmung von DNA-Konzentration und -Reinheit

Die DNA-Konzentration einer Probe kann durch Messung des

Absorptionsmaximums bei 260 nm bestimmt werden, wobei A

260

= 1 einer

Konzentration von 50 µg/mL DNA entspricht.

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