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3 Methoden

Tabelle 3.5: Übersicht über die Plasmidherstellung.

Ausgangsvektor Restriktions-

spaltung

Eingesetzter

Vektor

Restriktions-

spaltung

Zielvektor

MJmtrA1/pCRblunt NdeI, BamHI

pET-22b(+)

NdeI, BamHI MJmtrA1/pET22b+

MJmtrA2/pCRblunt NdeI, NcoI

pET-22b(+)

NdeI, NcoI MJmtrA2/pET22b+

MJmtrA3/pCRblunt NdeI, EcoRI

pET-22b(+)

NdeI, EcoRI MJmtrA3/pET22b+

MJmtrA3/pCRblunt NdeI, EcoRI pACYC-Duet1 NdeI, MunI MJmtrA3/pACYC-Duet1

MJmtrH/pCRblunt NdeI, EcoRI

pET-22b(+)

NdeI, EcoRI MJmtrH/pET22b+

MJmtrH/pCRblunt NdeI, EcoRI pACYC-Duet1 NdeI, MunI MJmtrH/pACYC-Duet1

Zur Analyse der Klonierungen wurden je 3 µL des Ligationsansatzes in E. coli

DH5α-Zellen oder One Shot

TOP10 chemically competent E. coli (Invitrogen,

Carlsbad, USA) wie beschrieben transformiert (Abschnitt 3.2.4) und die Zellen

angezogen. Aus den Kolonien der positiven Klone wurden sodann die Plasmide

isoliert (siehe Abschnitt 3.2.5), diese mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut

(siehe oben) und die entstandenen DNA-Fragmente mittels Agarosegel-

elektrophorese (siehe Abschnitt 3.2.6) auf die Anwesenheit des Zielgens überprüft.

Des Weiteren wurden die hergestellten Plasmide durch Sequenzierung (siehe

Abschnitt 3.2.9) kontrolliert.

3.2.4 Herstellung von kompetenten E. coli-Zellen und Transformation

Zur Herstellung Hitzeschock-kompetenter E. coli-Zellen wurde eine Variante der

Rubidiumchlorid-Methode verwendet (112). 50 mL LB-Medium (ggf. mit geeignetem

Antibiotikum) wurden mit 100 µL einer Übernacht-Kultur angeimpft und bis zu einer

600

von 0,3-0,5 bei 37 °C angezogen. Die Bakteriensuspension wurde kurz auf Eis

gekühlt, zentrifugiert (3000 x g, 4 °C, 10 min), das Pellet in 15 mL eisgekühltem

TF-Puffer 1 (30 mM K-Acetat pH 5,8, 10 mM CaCl

, 100 mM RbCl, 50 mM MnCl

15 % (v/v) Glycerin) resuspendiert und 15 min auf Eis inkubiert. Nach erneutem

Zentrifugieren (3000 x g, 4 °C, 10 min) wurde das Pellet in 2 mL eisgekühltem

TF-Puffer 2 (10 mM MOPS/KOH pH 7,0, 10 mM RbCl, 75 mM CaCl

, 15 % (v/v)

Glycerin) resuspendiert. Je 100 µL Bakteriensuspension wurde in flüssigem

Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert.

Zur Transformation von 50 µL kompetenten Zellen ließ man diese auf Eis

auftauen und inkubierte nach Zugabe von 1 µL Plasmid-Lösung für 30 min bei 0 °C.

Nach dem Hitzeschock (42 °C, 60 s) kühlte man 2 min auf Eis. Die Zellen wurden

nach Zugabe von 250 µL SOC-Medium 1 h bei 37 °C geschüttelt und schließlich auf

LB-Agar-Platten mit geeignetem Antibiotikum ausgestrichen. Die Transformanden

wurden bei 37 °C über Nacht angezogen.

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