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3 Methoden

3.4.4 Elektrophoretischer Proteintransfer und direkter ELISA (Western Blot)

Um die durch SDS-Page aufgetrennten Proteine aus der Polyacrylamidmatrix auf

PVDF-Membranen zu übertragen, wurde nach der Methode des semi-dry-Blottings

mit diskontinuierlichem Puffersystem verfahren (119, 120). Ein Stapel aus mit

Transferpuffer (25 mM TRIS/150 mM Glycin pH 8,3, 10 % (v/v) Methanol) getränkten

Filterpapieren (Whatman

Paper Grade I, Schleicher & Schuell, Kassel), Gel und

Membran (Imobilon P, Millipore, Schwalbach) wurde horizontal zwischen zwei

Plattenelektroden gelegt. Durch Anlegen eines elektrischen Feldes (60-70 mA/pro

Gel, 1,5 h, 4 °C) wurden die Proteinbanden im Gel auf die Membran übertragen.

Anschließend wurde die Membran zunächst über Nacht bei 4 °C mit BSA

geblockt (2 % (w/v) in TBST-Puffer (10 mM TRIS/HCl pH 8,0, 150 mM NaCl,

0,05 % (w/v) Tween 20), dann mit konjugierten Antikörpern (Anti-Polyhistidin-

Alkalische Phosphatase-Konjugat aus Maus oder Anti-Strep-Alkalische

Phosphatase-Konjugat aus Maus; Qiagen, Hilden) in einer Verdünnung von 1:2000

in TBST-Puffer 2 h bei RT behandelt.

Anti-M. marburgensis MtrH-Antikörper wurden von der Firma Genovac (Freiburg)

durch Immunisierung mit zwei synthetisch hergestellten Peptiden (AS 133-147:

(C)AADESELEALKNTKL und AS 231-249: (C)PSAWDWLREYUKEHKEAWP), die

mit den Immunstimulatoren KLH (Keyhole limpet Hämocyanin) und Ovalbumin

konjugiert worden waren, aus Kaninchenserum gewonnen. Die Membran wurde

1,5 h mit Anti-M. marburgensis MtrH-Antikörpern in einer Verdünnung von 1:2000 in

TBST-Puffer behandelt, mit TBST-Puffer gewaschen und schließlich 1,5 h mit

sekundären Antikörpern (Anti-Kaninchen IgG F(ab’)

-Fragment-Alkalische

Phosphatase-Konjugat aus Ziege; 1:3000 in TBST) behandelt.

Nach Waschen der Membran in TBST- und AP-Puffer (100 mM TRIS/HCl pH 9,5,

100 mM NaCl, 5 mM MgCl

) wurden die Antikörper durch eine Farbreaktion mit BCIP

und NBT detektiert (121, 122).

3.4.5 Analytische Gelfiltration

Zur Überprüfung der Reinheit und Einheitlichkeit von Proteinproben, zur

Molekulargewichtsbestimmung und Analyse des oligomeren Zustands von Proteinen

bzw. Proteinkomplexen sowie zur Erprobung verschiedener

Pufferzusammensetzungen wurde die Methode der analytischen Gelfiltration

verwendet. Diese wurde mit Hilfe des SMART-Systems (GE Healthcare, München)

bei 4 °C durchgeführt.

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