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MTD 243-670 Bedienungsanleitung Seite 48

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3 Methoden
Proteine hingegen zeigen ein Absorptionsmaximum bei 280 nm, sodass das
Verhältnis A
260
/A
280
zur Überprüfung der Probe auf Kontaminationen genutzt werden
kann. Hierbei gilt:
A
260
/A
280
= 1: reine DNA
A
260
/A
280
> 1: RNA-Verunreinigungen
A
260
/A
280
< 1: Protein-Kontamination.
Eine weitere Möglichkeit zur Bestimmung der DNA-Konzentration stellt die
Abschätzung anhand eines Vergleichs der Intensitäten der Banden im Agarosegel
mit den Banden des DNA-Längenstandards mit bekannten Konzentrationen dar.
3.2.9 Sequenzierung
Zur Überprüfung der Klonierungen wurden die hergestellten Plasmide mittels der
Didesoxymethode nach Sanger et al. (113) von den Firmen Seqlab (Göttingen) oder
Agowa (Berlin) sequenziert. Pro Sequenzierung wurden 0,7 ng DNA lyophylisiert und
eingeschickt. Die verwendeten Primer und ihre Sequenzen sind in Tabelle 3.6, die
Ergebnisse der Sequenzierungen im Anhang (Abschnitt 7.4) aufgeführt. Zur
Überprüfung der Elektropherogramme wurde das Programm Chromas 2.33
(Technelysium, Tewantin, Australien) verwendet.
Tabelle 3.6: Für Sequenzierungsreaktionen verwendete Primer.
Nr. Vektor Primer Richtung Sequenz 5’ → 3’
1 MJmtrH/pCRblunt M13 Reverse
M13 Forward (-20)
rückwärts
vorwärts
CAGGAAACAGCTATGAC
GTAAAACGACGGCCAG
2 MJmtrH/pet22b+ T7-Promotor
T7-Terminator
vorwärts
rückwärts
AATACGACTCACTATAGGG
GCTAGTTATTGCTCAGCGG
3 MJmtrA1/pCRblunt M13 Reverse
M13 Forward (-20)
rückwärts
vorwärts
CAGGAAACAGCTATGAC
GTAAAACGACGGCCAG
4 MJmtrA2/pCRblunt M13 Reverse
M13 Forward (-20)
rückwärts
vorwärts
CAGGAAACAGCTATGAC
GTAAAACGACGGCCAG
5 MJmtrA3/pCRblunt M13 Reverse
M13 Forward (-20)
rückwärts
vorwärts
CAGGAAACAGCTATGAC
GTAAAACGACGGCCAG
6 MJmtrH/pACYC-Duet1 Duet UP2 vorwärts TTGTACACGGCCGCATAATC
T7-Terminator rückwärts GCTAGTTATTGCTCAGCGG
7 MJmtrA3/pACYC-Duet1 Duet UP2 vorwärts TTGTACACGGCCGCATAATC
T7-Terminator rückwärts GCTAGTTATTGCTCAGCGG
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