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5 Diskussion

5.2.2 Des-[225-246]-MtrA (MJMtrA3) aus M. jannaschii

In dieser Arbeit konnte erstmalig um 22 C-terminale Aminosäuren verkürztes

MtrA aus M. jannaschii bis zur Homogenität gereinigt werden. Die Reinigung von

MtrA aus M. marburgensis als Apoprotein mit anschließender Rekonstituierung des

Holoproteins wurde bereits beschrieben, jedoch konnte in jener Arbeit das

Holoprotein nicht in monodispers Form erhalten werden (143). Im Unterschied zu

dem bereits veröffentlichten Protokoll wurde im hier vorliegenden Fall Cofaktor

Vitamin B

12a

schon zum Lysepuffer zugegeben. Die MJMtrA3 enthaltenden

Fraktionen konnten während der Reinigung durch ihre rötliche Farbe und die

Absorption bei 365 nm identifiziert werden. Auch nach erneuter Zugabe von Vitamin

12a

, Dialyse und zweimaliger Gelfiltration blieben diese Eigenschaften erhalten.

Die bei SDS-Pages auftretende 24 kDa-Bande ließ sich per ESI-MS eindeutig als

MJMtrA3 identifizieren. Das apparente Molekulargewicht stimmte mit dem anhand

der Aminosäuresequenz berechneten überein und das in der Literatur beschriebene

Auftreten verringerter elektrophoretischer Mobilität des denaturierten Proteins bzw.

des Apoproteins im Vergleich zum rekonstituierten Holoprotein ließ sich nicht

beobachten (56, 57, 143). Dies wurde als weiterer Hinweis gewertet, dass MJMtrA3

als korrekt gefaltetes Holoprotein mit gebundenem Cofakor Vitamin B

12a

gereinigt

werden konnte.

Die Aufnahme eines UV/Vis-Spektrums des gereinigten Proteins zeigte ein

Absorptionsmaximum bei 365 nm, das demjenigen von ungebundenem Vitamin B

12a

entsprach. Dagegen sind bei rekonstituiertem MtrA aus M. marburgensis die für

Cob(II)amid enthaltende Corrinoidproteine typischen Absorptionsmaxima von

278 nm, 315 nm, 424 nm und 492 nm zu finden. Die Präparation von MJMtrA3 fand

im Gegensatz zu M. marburgensis MtrA ohne Reduktionsmittel, wie z. B. DTT, unter

aeroben Bedingungen statt, sodass bei MJMtrA3 eventuell eine Bindung von

Cob(III)alamin vorliegen könnte. Eine weitere Untersuchung mittels EPR- oder NMR-

Spektroskopie könnte hier Klarheit schaffen.

Sowohl an MtrA gebundenes Cob(I)alamin als auch Methylcob(III)alamin werden

als Zwischenstufen der vom Mtr-Komplex katalysierten Methylübertragungsreaktion

angenommen (56, 57). Die Methylierungs- bzw. Demethylierungsreaktion und damit

verbundene Oxidation und Reduktion von enzymgebundenem Cobalamin sind

vermutlich der Auslöser von Konformationsänderungen, welche wiederum mit dem

vektoriellen Natriumtransport über die Membran gekoppelt sind (58).

EPR-spektroskopische Studien und Mutationsversuche mit rekonstituiertem MtrA aus

M. marburgensis deuteten darauf hin, dass Cob(II)alamin in der base-off/His-on-

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