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3 Methoden

Superose 6

Gelfiltration:

↓

Q-Sepharose

Ionenaustauschchromatographie:

↓

DEAE-Sepharose

Ionenaustauschchromatographie:

↓

Solubilisierte Membranen

Abbildung 3.1:

Übersicht über die Reinigung des Mtr-Komplexes aus M. marburgensis.

Solubilisierung:

Die wie in Abschnitt 3.5.1 beschrieben präparierten Membranen wurden für den

Gesamtkomplex (MtrA-H) in 80 mL Solubilisierungspuffer 1 (50 mM MOPS/KOH

pH 7,0, 10 mL MgCl

, 2 mM DTT, 2,5 % LM), für den Komplex ohne Untereinheit

MtrH (MtrA-G) in 40 mL Solubilisierungspuffer 2 (50 mM TRIS/HCl pH 7,6, 2 mM

DTT, 2,5 % LM) aufgenommen, homogenisiert und über Nacht bei 4˚C inkubiert.

Durch Ultrazentrifugation (100 000 x g, 1,5 h, 4˚C) wurden verbliebene Membranteile

a/jointfilesconvert/483107/bgetrennt.

Ionenaustauschchromatographie mit DEAE-Sepharose:

Das Membransolubilisat (siehe vorheriger Abschnitt) wurde durch eine 0,2 µm-

Membran filtriert und einer Ionenaustauschchromatographie auf

DEAE Sepharose™ FF (HR 16/10-Säule, CV: 19 mL) unterzogen. Eluiert wurde

durch graduelle Erhöhung der NaCl-Konzentration von 0-60 % Puffer B in 5 CV und

von 60-100 % Puffer B in 2 CV bei einer die Flussrate von 0,5 mL/min

(Pufferlösungen wie folgt). Die Mtr enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt.

Puffer A.1 (für MtrA-H): 50 mM MOPS/KOH pH 7,0, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,1 % LM

Puffer B.1 (für MtrA-H):

50 mM MOPS/KOH pH 7,0, 1 M NaCl, 2 mM DTT, 0,1 % LM

Puffer A.2 (für MtrA-G):

50 mM TRIS/HCl pH 7,6, 2 mM DTT, 0,1 % LM

Puffer B.2 (für MtrA-G):

50 mM TRIS/HCl pH 7,6, 1 M NaCl, 2 mM DTT, 0,1 % LM

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