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MTD 243-670 Bedienungsanleitung Seite 62

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3 Methoden
Die rückgefaltete Proteine wurden wiederum einer Gelfiltration auf Superdex 200
(Superdex 200 PC 3.2/30, CV: 2,6 mL) bei 4 °C und Flussrate 50 μL /min
unterzogen. Es wurde mit 1,2 CV Gelfiltrationspuffer (50 mM MOPS/KOH pH 7,0,
100 mM NaCl, 0,5 % OG) eluiert und zur Detektion die Absorption bei 280 nm
gemessen, sowie die Fraktionen mittels SDS-Page analysiert.
3.5.6 Reinigung von rekombinantem des-[238-252]-MtrA mit C-terminalem
StrepII-Anhängsel (MKMtrA) aus M. kandleri
Die nach der Beschreibung in Abschnitt 3.3.3 gewonnenen E. coli-Zellen wurden
in 7,5 mL Lysepuffer (50 mM MOPS/KOH pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM PMSF,
0,1 mM Vitamin B
12a
) pro g Bakterienfeuchtgewicht resuspendiert und mit 267 µg/mL
Lysozym und 67 µg/mL DNAse I 30 min bei RT inkubiert. Nach der
Ultraschallbehandlung (15 min, Puls: 50 %, Leistung: 5 W, 0 °C) wurde das
Zelldebris durch Zentrifugation (43 000 x g, 30 min, 4 °C) pelletiert und die
Zellmembranen aus dem Überstand durch Ultrazentrifugation (150 000 x g, 1 h, 4 °C)
entfernt.
Zur Fällung der E. coli-Proteine wurde der Überstand (lösliche Fraktion) zunächst
für 30 min auf 70 °C erhitzt, dann über Nacht auf 4 °C gekühlt. Denaturiertes Protein
wurden durch Ultrazentrifugation entfernt (150 000 x g, 1 h, 4 °C).
Der MKMtrA enthaltende Überstand wurde auf 500 µL konzentriert (Konzentrator
mit 10 kDa MWCO), durch eine 0,2 µm-Membran filtriert und auf eine mit Puffer W
(100 mM TRIS/HCl pH 8,0, 150 mM NaCl) äquilibrierte Strep-Tactin
®
-Säule
(Strep-Tactin
®
Spin Column, CV: 1 mL) aufgetragen. Es wurde nach Angaben des
Herstellers (IBA, Goettingen) nach viermaligem Waschen mit je 100 µL Puffer W mit
2 x 50 µL Puffer BE (100 mM TRIS/HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM
D-Biotin) eluiert.
Die gewonnenen Proben wurden mittels Western Blot analysiert.
3.5.7 Reinigung von rekombinanter F
420
-abhängiger N
5
,N
10
-Methylen-H
4
MPT-
Dehydrogenase (KMtd) aus M. kandleri
Die Reinigung der F
420
-abhängigen N
5
,N
10
-Methylen-H
4
MPT-Dehydrogenase
(KMtd) aus M. kandleri wurde wie bei Klein und Thauer (123) beschrieben von Frau
Ulrike Demmer am Max-Planck-Institut für Biophysik in Frankfurt durchgeführt.
Die Substrate H
4
MPT und Methenyl-H
4
MPT
+
sowie das Cosubstrat F
420
wurden
aus M. marburgensis-Zellen von Frau Johanna Moll am Max-Planck-Institut für
terrestrische Mikrobiologie in Marburg gereinigt (124, 125). Methylen-H
4
MPT
45
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