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4 Material und Methoden

4.9.23 Screening einer partiellen Genbank durch Koloniehybridisierung

Die Koloniehybridisierung wurde nach Sambrook und Russell (2001) mit einer

radioaktiv markierten Sonde durchgeführt. Die Plasmide wurden anschließend aus

positiven Klonen präpariert und deren Richtigkeit über einen Dot-Blot verifiziert.

Danach wurde die Sequenz der eingefügten Fragmente bestimmt.

4.9.24 Screening einer genomischen DNA Phagenbank aus M. Voltae

Eine Genombank von M. voltae in Form einer Phagenbank lag für die vorliegende

Arbeit zur Verfügung (Noll, I., dieses Labor). Die durchschnittliche Fragmentlänge lag

bei ca. 5 kb. Aufgrund der Genomgröße von M. voltae von 1900 kb ergab sich

daraus eine theoretische Anzahl von 380 zu untersuchenden Phagen, um das

Genom vollständig abzudecken.

Für das erste Screening wurde eine Anzahl von 500 Plaques pro Platte gewählt. Das

Screening erfolgte nach den Angaben des Herstellers des Lambda ZAP II Express

Predigested Vector Kit (Stratagene, Heidelberg). Die Phagen wurden jedoch nicht

auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen, sondern auf eine positiv geladene

Nylonmembran (Roti

-Nylon plus, Carl Roth, Karlsruhe). Die Hybridisierung der Filter

erfolgte dagegen wie beschrieben. Die Plasmide wurden aus positiven Klonen

präpariert und deren Richtigkeit über einen Dot-Blot verifiziert. Anschließend erfolgte

eine Sequenzierung der in den Plasmiden enthaltenen Fragmente.

4.10 Chromatographische Methoden

4.10.1 Gaschromatographischer Nachweis von CH

Für den gaschromatographischen Nachweis von Methan wurde 1 ml einer M. voltae-

Kultur bei einer OD

600

von 0,8 geerntet und für 5 min und bei 13 000 x g und

Raumtemperatur sedimentiert. Der Zellniederschlag wurde dreimal mit 0.4 M NaCl,

15 mM NaAcetate, 14 mM MgSO4, 14 mM MgCl

, 5 mM KCl, 5 mM NH4Cl, 1 mM

HPO

, 1 mM CaCl2 gewaschen und in 1 ml desselben Puffers aufgenommen. Die

1 2 ... 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 ... 100 101

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