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4 Material und Methoden

pNPAC-sdmC Integrationsvektor für M. voltae mit

sdmC flankierenden Sequenzen

Diese Arbeit

pNPAC-sdmBC Integrationsvektor für M. voltae mit

sdmB und sdmC flankierenden

Sequenzen

Diese Arbeit

4.7.1 Konstruktion der Plasmide pNPAC-sdmA, -sdmB, -sdmC und

-sdmBC

Die in der vorliegenden Arbeit konstruierten Plasmide sind Derivate des Vektors

pNPAC. Dieser trägt zur Selektion das Gen pacN (Zugangsnummer AY438700),

welches der „codon usage“ von M. voltae angepasst ist und für die Puromycin-N-

Acetyltransferase kodiert. Zur Herstellung des Vektors pNPAC-sdmA wurde mit den

Oligonukleotiden corsevorfw und corsevorrv das Fragment sdmAup (up bezeichnet

die 5`-Region vor dem Gen) und mit den Oligonukleotiden corsenachfw und

corsenachrv das Fragment sdmAdown (down bezeichnet die 3´-Region hinter dem

Gen) mittels einer PCR amplifiziert. Nach der Auftrennung in einem Agarosegel

wurden die Fragmente zunächst in den Vektor Topo pCR 2.1 eingesetzt. Das

Fragment sdmAup trug am Ende die Restriktionsschnittstelle Spe I bzw. Nru I und

sdmAdown die Schnittstelle Kpn I bzw. Nhe I. Diese waren so gewählt, dass sich die

beiden Fragmente nach dem Einsetzen in den zu konstruierenden Vektor in der

gewünschten Orientierung befanden. Der Vektor pNPAC-sdmA wurde durch das

Einfügen der beiden Fragmente aus dem Zwischenprodukt in pNPAC über die oben

benannten Schnittstellen erhalten (Abb. 3).

Die Vektoren pNPAC-sdmB, -sdmC und -sdmBC wurden über die gleichen

Schnittstellen wie pNPAC-sdmA hergestellt. Jedoch wurde das Fragment sdmBup

über die Oligonukleotide metIvorfw und metIvorrv, sdmBdown über die

Oligonukleotide metInachfw und metInachrv, sdmCup über die Oligonukleotide

metIIvorfw und metIIvorrv und sdmCdown über die Oligonukleotide metIInachfw und

metIInachrv amplifiziert (Abb. 3 und Abb. 4).

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