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4 Material und Methoden

4.9.15 Transfektion von M. voltae

Die Transfektion von M. voltae erfolgte in anaerober Atmosphäre (5% H

, 20% CO

75% N

) nach Metcalf et al. (1997). Dazu wurde linearisierte DNA (ca. 5 pmol) gefällt

und anschließend in 225 µl 20 mM Hepes-Puffer, pH 7,0 aufgenommen. Nach der

Zugabe von 25 µl Escort

Transfection Reagent (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) wurde

der Ansatz für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zwischenzeitlich wurde 1 ml

einer M. voltae-Kultur mit einer OD

600

zwischen 0,3 - 0,6 durch Zentrifugation bei

13 000 x g für 5 min sedimentiert und die Zellen in 0,5 ml 0,68 M Saccharose-

Lösung resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann mit der DNA-Lösung

vermischt, nach 2 h in 10 ml Medium überführt und ohne Selektion bei 37°C

inkubiert. Die Zugabe von Puromycin zu einer Endkonzentration von 10 µg/ml

erfolgte nach 3 h. Die Zellen wurden bis zum Erreichen von einer OD

600

von 1

kultiviert und dann zur Selektion auf puromycinhaltigem Festmedium ausplattiert.

4.9.16 Qualitativer und quantitativer Glucuronidase-Reportergentest

Der Glucuronidasetest erfolgte qualitativ modifiziert nach Beneke et al. (1995). Zur

Aktivitätsbestimmung wurde 1 ml M. voltae-Kultur mit einer OD

600

von 0,5 bei

13 000 x g für 5 min sedimentiert und der Überstand a/jointfilesconvert/481994/bgenommen. Bei Bedarf wurde

der Niederschlag bei –80 °C bis zur Messung gelagert. Die Zellen wurden in 1 ml

20 mM K-Phosphat-Puffer, pH 7,0 100 mM β-Mercaptoethanol lysiert und für 5 min

schüttelnd inkubiert. Nach Zentrifugation bei 13 000 x g und 4°C für 5 min wurden

0,5 ml des Überstandes zu einer Endkonzentration von 1 mM mit PNPGluc (4-

Nitrophenyl-ß-1,4-Glucuronid) vermischt und für 1 h bei 37°C inkubiert.

Zur quantitativen Aktivitätsbestimmung wurden die Zelltrümmer nach dem Schütteln

durch Zentrifugation bei 13 000 x g für 5 min und 4°C sedimentiert. 30 µl des

Überstandes wurden mit 300 µl 20 mM K-Phosphat-Puffer, pH 7,0 100 mM β-

Mercaptoethanol, 1 mM PNPGluc vermischt und die Reaktion dadurch gestartet. Die

Extinktion der Lösung wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen und in

60 minütlichen Intervallen bei 28°C verfolgt. Mit Hilfe einer Eichgeraden mit

p-Nitrophenol wurde die Aktivität der Glucuronidase bestimmt und in mU (nmol

Nitrophenol/min)/mg Gesamtprotein angegeben.

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