MTD 243-670 Bedienungsanleitung

Entschlüsselung der Genome von Ralstonia eutropha H16 und Methanosphaera stadtmanae und vergleichende Untersuchungen zu Anpassungen der Genomor

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Lys Lysin µ Mikro M Molar Mbp Megabasenpaare Mbr. Methanobrevibacter Mca. Methanococcus MCM minichromosome main

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Zu den Genen für das Tc-Toxin TcdA1 und die Potentiatoren TcdB1 und TccC1 konnten analoge CDSs in einem Cluster auf Chr.2 identi

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.II Das Methanosphaera stadtmanae-Genomprojekt Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Methanosphaera stadtmanae

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.II.1.2 Rohsequenzierung Rechnerisch ergibt sich bei einer Genomgröße von 1.8 Mbp, einer angestrebten Se-quenzabdeckung von sie

ERGEBNISSE KAPITEL 3 010020030040050060070080090010000 5.000 10.000 15.000 20.000Anzahl der SequenzläufeSequenzlückenAbb. 3.23: Verlauf der Rohsequen

ERGEBNISSE KAPITEL 3 verlässigkeit des Datensatzes innerhalb kurzer Zeit erhöht und die Anzahl der Contigs größer 3 kbp von 117 auf 53 verringert wer

ERGEBNISSE KAPITEL 3 schweig (DSMZ) angezogen worden waren. Mit Hilfe von PCR-Amplifikationen konn-te gezeigt werden, daß die kürzere Variante der 23

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.II.2 Sequenzanalyse 3.II.2.1 Allgemeine Eigenschaften Methanosphaera stadtmanae besitzt ein relatives kleines Genom, das in ei

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Ein Teil der genomischen DNA, die aus Zellkulturen der DSMZ, Braunschweig isoliert wurde, enthält ein verkürztes Operon 2, desse

ERGEBNISSE KAPITEL 3 SkalierungCDSsGene der MethanogeneseHoch-exprimierte GeneRNA-GeneAbb. 3.25: Schematische Darstellung des Genoms von Msp. stadt

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.II.2.2 Replikationsursprung Wenig ist bisher über Mechanismen bekannt, die zur Initiation der Replikation in Ar-chaeen führen.

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS R-M-System Restriktions-Modifikations-System RNA ribonucleic acid rRNA ribosomale RNA RT Raumtemperatur s Sekunde S

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Abb. 3.26: Kumulative GC-Skew-Analyse des Msp. stadtmanae-Genoms nach Grigoriev (1998). 3.II.2.3 Potentiell hochexprimierte G

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Tab. 3.19: Potentiell hochexprimierte Gene im Genom von Msp. stadtmanae nach SIGI-Vorhersage. Positionsangaben ausgehend vom Rep

ERGEBNISSE KAPITEL 3 und in Methanosarcina mazei (Ruppert et al., 1998) und Methanothermobacter thermautotrophicus (Smith et al., 1997) beschrieben w

ERGEBNISSE KAPITEL 3 CoM-S-S-CoBHS-CoM + HS-CoBHS-CoB CH4?H2?MethanolMethyl-S-CoMMethyl-H4MPTMethylen-H4MPTMethenyl-H4MPTFormyl-H4MPTFormyl-M

ERGEBNISSE KAPITEL 3 In Msp. stadtmanae wird Methanol nur über den reduktiven Zweig des methylo-trophen Weges umgesetzt, deshalb benötigt der Organis

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Tab. 3.20: Untereinheiten der Methanol:CoM-Methyltransferase. Positionsangaben ausge-hend vom Replikationsursprung im Uhrzeigers

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3. In Mth. marburgensis bilden Heterodisulfid-Reduktase und F420-non-reducing-Hydrogenase einen membranassoziierten, stabilen H2

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Allerdings weist das hdrC2B2A2-Operon aus Msp. stadtmanae eine andere Organisation auf als vergleichbare Operons aus den Methano

ERGEBNISSE KAPITEL 3 wird die resultierende Formyl-Gruppe durch die Formyl-MFR:H4MPT-Formyl-Transferase auf Tetrahydromethanopterin (H4MPT) übertrage

ERGEBNISSE KAPITEL 3 abhängigen Formyl-MFR-Dehydrogenase, Isoenzym II, aus Mth. marburgensis aufweist als zu dem entsprechenden Isoenzym I. Da sich j

EINLEITUNG KAPITEL 1 1 Einleitung Die Entschlüsselung eines mikrobiellen Genoms unterteilt sich im wesentlichen in zwei Schritte: Sequenzierung und S

ERGEBNISSE KAPITEL 3 4. Zu den Enzymen Methenyl-H4MPT-Cyclohydrolase, Methenyl-H4MPT-Dehydrogenase und Methenyl-H4MPT-Reduktase wurden in Msp. stadt

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.II.5 Genomvergleiche Um Unterschiede in den spezifischen Eigenschaften von Msp. stadtmanae zu untersu-chen, wurden bidirektion

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Tab. 3.23: Kodierende Sequenzen, die mit Hilfe bidirektionaler BLAST-Vergleiche in allen methanogenen Archaeen mit Ausnahme von

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Für diesen Vergleich wurden zunächst die gemeinsamen Proteine aller methano-genen Archaeen einschließlich Msp. stadtmanae bestim

ERGEBNISSE KAPITEL 3 2. Aus der Molybdän-Cofaktor-Biosynthese fehlen in Msp. stadtmanae die drei Gene moaABC. Das Übergangsmetall Molybdän wird in me

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.II.5.2.1 Enzyme der Zellwandsynthese Unter denjenigen CDSs, die keine Ähnlichkeit zu bisher identifizierten Proteinen ande-rer

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Tab. 3.24: Kodierende Sequenzen für potentielle Enzyme der Zellwandsynthese aus Msp. stadtmanae Gene, die keine bidirektionalen

ERGEBNISSE KAPITEL 3 ren hypothetische Proteine aus Parachlamydia sp., Mannheimia succiniproducens MBEL55E, Escherichia coli O157:H7, Plasmodium fal

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.II.5.2.2.1 Zusammensetzung der überlangen ORFs und Proteine Den überlangen ORFs aus Msp. stadtmanae können weitere spezifische

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.II.5.2.2.2 Aufbau der überlangen Proteine Innerhalb der überlangen Proteine konnten weder bekannte konservierte Domänen noch b

EINLEITUNG KAPITEL 1 Eigenschaften des Genoms zu charakterisieren, die sich erst aus der Untersuchung der Sequenz ergeben und die Hinweise auf unbeka

ERGEBNISSE KAPITEL 3 • Überlange Proteine weisen eine in Domänen organisierte Architektur auf, in der kurze Sequenzmotive von wenigen Aminosäuren Lä

DISKUSSION KAPITEL 4 4 Diskussion 4.I Das Ralstonia eutropha H16-Genomprojekt 4.I.1 Das R. eutropha H16-Genom Das Genom von R. eutropha H16 besteht a

DISKUSSION KAPITEL 4 4.I.2 Charakterisierung von Chromosom 2 aus R. eutropha H16 Hinsichtlich des fakultativ anaeroben und fakultativ lithoautotrophe

DISKUSSION KAPITEL 4 schenprodukt Protocatechuat abgebaut werden; andererseits werden mit dem meta-Spaltungs- und wahrscheinlich auch dem Gentisat-We

DISKUSSION KAPITEL 4 4.I.3 Genomorganisation in R. eutropha H16 Vergleichende Analysen der Replikons aus R. eutropha H16 untereinander geben Grund zu

DISKUSSION KAPITEL 4 det sich zur Zeit in einem fortgeschrittenen Stadium der Sequenzierung am DOE Joint Genome Institute, Kalifornien und ist dort ö

DISKUSSION KAPITEL 4 ABCDEFAbb. 4.1: Bidirektionale BLAST-Vergleiche auf Proteinebene (> e-15) zwischen Chr.1 und 2 und den Replikons verschiedene

DISKUSSION KAPITEL 4 Tab. 4.2: Bidirektionale BLAST-Vergleiche auf Proteinebene (> e-15) zwischen Chr.1 und 2 aus R. eutropha H16 und den Replikon

DISKUSSION KAPITEL 4 1. In R. solanacearum GMI1000, Bu. mallei ATCC 23344 und Bu. pseudomallei 2. n Genome wurden außerdem Hinweise Bu. mallei ATC

DISKUSSION KAPITEL 4 CH34 (zwei repA-Gene) identifiziert. In den Vergleich miteinbezogen wurden außer-dem RepA-analoge Proteine von zwei Plasmiden mi

EINLEITUNG KAPITEL 1 Pathogene. Die industrielle Nutzung vieler Spezies wird allerdings durch ihre schädli-che Wirkung auf den Menschen erschwert. Bi

DISKUSSION KAPITEL 4 Wie dieser Vergleich belegt, enthalten alle Burkholderiaceae-Genome neben dem Chromosom ein mutmaßliches Megaplasmid, dessen Ver

DISKUSSION KAPITEL 4 Phosphogluconat-DehydrataseEC 4.2.1.12R. eutropha H16 R. eutropha JMP134 R. solanacearum GMI1000 R. metallidurans CH34 Glucose-6

DISKUSSION KAPITEL 4 sätzlicher Eigenschaften zu nutzen. Als Folge dieser Plastizität könnte es im Laufe der Zeit zu einer Verlagerung von Haushaltsg

DISKUSSION KAPITEL 4 4.I.9 Bemerkungen zur taxonom. Einteilung der Burkholderiaceae Innerhalb der letzten Jahre hat eine taxonomische Neuordnung des

DISKUSSION KAPITEL 4 Innerhalb der Familie der Burkholderiaceae verteilen sich die kodierende Eigen-schaften des Genoms auf mehrere Replikons, die un

DISKUSSION KAPITEL 4 4.II Das Methanosphaera stadtmanae-Genomprojekt 4.II.1 Das Methanosphaera stadtmanae-Genom Mit Msp. stadtmanae wurde das erste k

DISKUSSION KAPITEL 4 Usage auf, die sie als hochexprimiert charakterisiert und die elementare Funktion dieser Enzyme im Stoffwechsel von Msp. stadtma

DISKUSSION KAPITEL 4 4.II.3 Kommensalismus Bis zu 1012 kommensale Mikroorganismen leben in jedem Gramm Darminhalt des Menschen (Mackie et al., 1999).

DISKUSSION KAPITEL 4 Msp. stadtmanae im menschlichen Enddarm benötigt werden. Spezifische Enzyme der Zellwandsynthese deuten darauf hin, daß Msp. sta

DISKUSSION KAPITEL 4 fektionsprozesses zugeschrieben: Haftung an spezifische Gewebetypen während der Besiedelung und dauerhafte Überwindung von Abweh

EINLEITUNG KAPITEL 1 2. Methanosphaera stadtmanae gehört zu den methanogenen Organismen, die aus-schließlich in der Domäne der Archaeen gefunden werd

DISKUSSION KAPITEL 4 4.II.3.2 Überlange ORFs Msp. stadtmanae wendet ca. 10 % seiner Genomsequenz für die Kodierung einer Grup-pe von Proteinen auf, d

DISKUSSION KAPITEL 4 • Der Regulation der Expression alternativer Loci, wie sie die überlangen ORFs dar-stellen, kann durch verschiedene Mechanismen

DISKUSSION KAPITEL 4 • Mit Asparagin, Threonin und Serin liegen in den überlangen Proteinen gerade die drei Aminosäuren stark konzentriert vor, dere

DISKUSSION KAPITEL 4 Enzyme der Zellwandsynthese und die Gruppe der überlangen Proteine kodieren. Diese Synthese dürfte einen Großteil der Stoffwechs

DISKUSSION KAPITEL 4 Mutationsereignisse aber gleichzeitig ein Teil der kodierenden offenen Leserahmen ver-lorengehen. Möglicherweise deutet schließ

ZUSAMMENFASSUNG KAPITEL 5 5 Zusammenfassung 5.I Das Ralstonia eutropha-Genomprojekt 1. Die Chromosomen 1 und 2 des Genoms von R. eutropha H16 wurde

ZUSAMMENFASSUNG KAPITEL 5 Genomen und läßt auf ein gemeinsames Vorläufergenom schließen, das aus einem einzigen Chromosom bestand und sich durch Auf

ZUSAMMENFASSUNG KAPITEL 5 5. Eine umfangreiche und in sich homologe Gruppe Msp. stadtmanae-spezifischer CDSs von überdurchschnittlicher Länge und b

6 Literaturverzeichnis Albers, S. V. & Driessen, A. M. (2002). Signal peptides of secreted proteins of the archaeon Sulfolobus solfataricus: a ge

Bateman, A., Coin, L., Durbin, R., Finn, R. D., Hollich, V., Griffiths-Jones, S., Khanna, A., Mars-hall, M., Moxon, S., Sonnhammer, E. L., Studholme,

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2 Material und Methoden 2.1 Organismen und Plasmide Die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Bakterien-Stämme sind i

& Collmer, A. (2003). The complete genome sequence of the Arabidopsis and tomato pathogen Pseudo-monas syringae pv. tomato DC3000. Proc Natl Acad

Cohen, G. N., Barbe, V., Flament, D., Galperin, M., Heilig, R., Lecompte, O., Poch, O., Prieur, D., Querellou, J., Ripp, R., Thierry, J. C., Van der

del Solar, G. & Espinosa, M. (2000). Plasmid copy number control: an ever-growing story. Mol Micro-biol 37, 492-500. Delcher, A. L., Harmon, D.

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Gillespie, S. H., Ainscough, S., Dickens, A. & Lewin, J. (1996). Phosphorylcholine-containing antigens in bacteria from the mouth and respirator

Guilloton, M. B., Lamblin, A. F., Kozliak, E. I., Gerami-Nejad, M., Tu, C., Silverman, D., Ander-son, P. M. & Fuchs, J. A. (1993). A physiologic

Hochheimer, A., Hedderich, R. & Thauer, R. K. (1998). The formylmethanofuran dehydrogenase isoenzymes in Methanobacterium wolfei and Methanobacte

Ide, T., Bäumer, S. & Deppenmeier, U. (1999). Energy conservation by the H2:heterodisulfide oxido-reductase from Methanosarcina mazei Go1: identi

hida, N., Oguchi, A., Kikuchi, H. & et al. (1999). Complete genome sequence of an aerobic hyper-thermophilic crenarchaeon, Aeropyrum pernix K1. D

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2.2 Nährmedien und Puffer Alle aufgeführten Medien wurden durch Autoklavieren für 30 min bei 121 °C sterili-siert.

König, H., Kralik, R. & Kandler, O. (1982). Structure and modifications of pseudomurein in Methano-bacteriales. Zbl Bakt Hyg 1, 179-191. Koomey

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Macdonald, T. T. & Monteleone, G. (2005). Immunity, inflammation, and allergy in the gut. Science 307, 1920-1925. Mackie, R. I., Sghir, A. &

Meuer, J., Kuettner, H. C., Zhang, J. K., Hedderich, R. & Metcalf, W. W. (2002). Genetic analysis of the archaeon Methanosarcina barkeri Fusaro

Nambu, T. & Kutsukake, K. (2000). The Salmonella FlgA protein, a putativeve periplasmic chaperone essential for flagellar P ring formation. Micr

Parkhill, J., Sebaihia, M., Preston, A., Murphy, L. D., Thomson, N., Harris, D. E., Holden, M. T., Churcher, C. M., Bentley, S. D., Mungall, K. L., C

Reeve, J. N., Beckler, G. S., Cram, D. S., Hamilton, P. T., Brown, J. W., Krzycki, J. A., Kolodziej, A. F., Alex, L., Orme-Johnson, W. H. & Walsh

Rudolph, M. J., Wuebbens, M. M., Rajagopalan, K. V. & Schindelin, H. (2001). Crystal structure of molybdopterin synthase and its evolutionary re

Sauer, K., Harms, U. & Thauer, R. K. (1997). Methanol:coenzyme M methyltransferase from Metha-nosarcina barkeri. Purification, properties and enc

E., Theriault, C., Tolstrup, N., Charlebois, R. L., Doolittle, W. F., Duguet, M., Gaasterland, T., Garrett, R. A., Ragan, M. A., Sensen, C. W. &

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 Tab. 2.3: Medienzusätze Zusatz Stammkonzentration Endkonzentration Ampicillin Kanamycin IPTG X-Gal 100 mg/ml in H2

Srikhanta, Y. N., Maguire, T. L., Stacey, K. J., Grimmond, S. M. & Jennings, M. P. (2005). The phasevarion: A genetic system controlling coordina

Taghavi, S., Provoost, A., Mergeay, M. & van der Lelie, D. (1996). Identification of a partition and replication region in the Alcaligenes eutrop

Walderhaug, M. O., Polarek, J. W., Voelkner, P., Daniel, J. M., Hesse, J. E., Altendorf, K. & Ep-stein, W. (1992). KdpD and KdpE, proteins that c

Wiezer, A. & Merkl, R. (2003). secureBLAST. In Silico Biol 3, 405-409. Wilde, E. (1962). Untersuchungen über Wachstum und Speicherstoffsynthese

Danksagung Ganz besonders danke ich Herrn Prof. Dr. G. Gottschalk für seine uneingeschränkte Un-terstützung, die ich in jeder erdenklichen Hinsicht

Abseits von meiner Arbeit haben mir viele gute Freunde in schwierigen Zeiten geholfen – man könnte sagen: mich ertragen! Dafür danke ich Maik Heister

Lebenslauf Wolfgang Florian Fricke Kreuzbergring 2 37075 Göttingen Geburtsdatum, -ort 28.10.1974, Lemgo 08/1981 - 07/1984 Grund

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2.3.1.2 Anzucht von Methanospaera stadtmanae Methanosphaera stadtmanae wurde unter anaeroben Bedingungen bei 37 °C

D 7 Referent: Prof. Dr. G. Gottschalk Korreferent: Prof. Dr. B. Bowien Tag der mündlichen Prüfung: 30.06.2005

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2.3.2 Stammhaltung Zur kurzfristigen Stammhaltung wurden die rekombinanten E. coli-Stämme auf LB-Agar-Platten ausge

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2.4.3 DNA-Konzentrationsbestimmung und Reinheitskontrolle Die Konzentration wässriger DNA-Lösungen wurde photometri

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 Größenstandards aufgetragen (GeneRuler DNA Ladder Mix, Fa. Fermentas). Nach der Elektrophorese wurden die Gele in e

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 Überstand wurde abgenommen, das Pellet getrocknet und in 30 µl autoklaviertem H2Obidest gelöst. Zur Überprüfung der

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2.4.7 Isolierung von Plasmid DNA Für die Isolierung von Plasmid-DNA wurden je nach Anzahl der Proben verschiedene M

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2.4.9 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen DNA-Fragmente wurden z.B. aus Agarosegelen isoliert, wenn eine

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2.5 Modifikation von Nukleinsäuren 2.5.1 Restriktion Die enzymatische Restriktion mit Enzymen bekannter Spezifität

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2.5.3 Herstellung glatter DNA-Enden (blunt ends) Beim Scheren der chromosomalen DNA entstanden undefinierte Enden,

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 Die Herstellung von A-Überhängen wurde in dem oben angegebenen Ansatz für 25 min bei 72 °C durchgeführt. Anschließe

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 TOPO-Vektor besitzt in entsprechender Weise einen Thymidin-Überhang, der durch ei-ne spezielle Topoisomerase erzeug

INHALTSVERZEICHNIS Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung...

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 rekombinantes Plasmid mit Insert tragen, von denjenigen unterschieden werden, die nur den leeren Vektor enthielten.

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 (17-25 nt) und Schmelztemperatur (R. eutropha H16: 56-62 °C, Msp. stadtmanae: 44-47 °C) je nach Beschaffenheit des

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 Tab. 2.4: PCR-Programme, Standard-Ansatz. R. eutropha H16 Msp. stadtmanae LID PAUSE TEMP LOOP [ TEMP TEMP TEMP

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 Die in den Tab. 2.4 und Tab. 2.5 dargestellten Programme für die PCR-Amplifikation mit Standard- und TripleMaster-A

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 Das verhältnismäßig kleine Genom von Msp. stadtmanae (1.8 Mbp) wurde mit Hilfe ei-ner einzelnen Plasmid-Genbank seq

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 sche 5'-Markierung, deren Fluoreszenz vom Sequenzierautomaten detektiert wird. Aus der Integrierung der gemess

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 Tab. 2.6: ABI 377-Sequenzierprogramm. LID PAUSE TEMP LOOP [ TEMP TEMP TEMP LOOP ] LID TEMP END 110 °C 98 °C 98 °C

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 loading buffer EDTA Blue Dextran H2Obidest25 mM0.5 µlad 500 ml Stop-Mix Formamid : loading buffer =

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 Tab. 2.8: MegaBACE-Sequenzierprogramm LID PAUSE TEMP LOOP [ TEMP TEMP TEMP LOOP ] LID TEMP END 110 °C 95 °C 95 °C

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 Nach dem Ende der Rohsequenzierungsphase des Genomprojekts wurden alle Sequenz-läufe (readings), die sich aus dem A

INHALTSVERZEICHNIS 2.6 Transformation und Selektion ... 17 2.6.1 TOPO TA-Klo

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2.11.2 Lückenschluß mit PCR Mit Hilfe von PCR-Amplifikationen wurden die verbliebenen Sequenzlücken geschlos-sen, n

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 wurde das ERGO Programmpaket verwendet (Overbeek et al., 2003). Unter der Funk-tion contig regions können mit ERGO

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 2.12 BLAST Für die meisten Sequenzvergleiche auf DNA- und Proteinebene bietet sich wegen seiner Geschwindigkeit und

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 • BLAST-Abgleich der Genome gegeneinander: blastall -p blastp -i a.fas -d b.fas -e 1.0e-15 blastall -p blastp -i b

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 (Badger & Olsen, 1999), Glimmer (Delcher et al., 1999) und ZCurve (Guo et al., 2003) beruht und ab einer Contig

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 annotierten Genomen und den regelmäßig aktualisierten externen Datenbanken Swiss-Prot und TrEMBL zusammen (ftp.expa

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 quenzen starke Unterschiede zwischen den G+C-Gehalten der drei Codon-Positionen bestehen, kann aus dem GC Frame Plo

MATERIAL UND METHODEN KAPITEL 2 passung der Codon Usage an den tRNA-Gehalt des jeweiligen Organismus darstellen, werden von dem Programm SIGI als s

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3 Ergebnisse 3.I Das Ralstonia eutropha H16-Genomprojekt 3.I.1 Sequenzierung 3.I.1.1 Strategie Vor Beginn der Sequenzierung war

ERGEBNISSE KAPITEL 3 zu sogenannten Contigs assembliert, kontinuierlichen Sequenzabschnitten, die aus vie-len miteinander überlappenden Sequenzbereic

INHALTSVERZEICHNIS 3.I.1.3 Editierung des Rohdatensatzes... 39 3.I.1.3.1 Editierung de

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.I.1.3 Editierung des Rohdatensatzes Der aus der Rohassemblierung hervorgegangene Datensatz wurde mit dem Programm Gap4 in der

ERGEBNISSE KAPITEL 3 zelnen Base der Consensus-Sequenz einen Zuverlässigkeitswert (base confidence) zu-ordnet. Dieser Wert errechnet sich aus der Anz

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Abb. 3.3: Template Display des Contig 61-2-182-E06. Sequenzläufe werden durch Pfeile dargestellt und einem Template (Plasmid- o

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Abb. 3.4: Template Display von zwei Contigs, die über Plasmidbrücken (gelbe Templates) miteinander verbunden sind. Farbkodierun

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Abb. 3.5: Ribosomaler Contig mit Fehlassemblierungen (Pile up). Über dem gezeigten Ab-schnitt assemblieren unnatürlich viele Se

ERGEBNISSE KAPITEL 3 mit denen der gesamte Sequenzabschnitt über PCR amplifiziert werden konnte. PCR-Produkte dienten als Template für Primerwalking.

ERGEBNISSE KAPITEL 3 mit diesem pHG1-Konstrukt abgeglichen und bei übereinstimmender Sequenz mitein-ander assembliert. 2. Um die restlichen Contigs

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.I.1.4.2 Ordnung der Contigs relativ zum Genom 3.I.1.4.2.1 Bildung von Supercontigs über Cosmid-Brücken Analog zur Darstellung

ERGEBNISSE KAPITEL 3 R. eutropha-Genomprojektes auf zwei Supercontigs für Chr.1 und Chr.2 verteilt wer-den. 3.I.1.5 Lückenschluß Für die Sequenzieru

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Abb. 3.7: Abgebrochene Sequenzläufe aufgrund der Bildung einer Sekundärstruktur. In einer Darstellung der Sekundärstruktur als

INHALTSVERZEICHNIS 3.I.4.2.3 Alternative Phosphorquellen ... 80 3.I.4.3 Synthese von Pyrro

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.I.2 Sequenzanalyse Das Genom von Ralstonia eutropha H16 besitzt nach jetzigem Stand eine Gesamtgröße von 7 417 135 bp, die sic

ERGEBNISSE KAPITEL 3 SkalierungCDSs“Fremd-Gene”RNA-GeneAbb. 3.8: Schematische Darstellung von Chr.1. Von innen nach außen werden folgende Ei-genschaf

ERGEBNISSE KAPITEL 3 SkalierungCDSs“Fremd-Gene”RNA-GeneAbb. 3.9: Schematische Darstellung von Chr.2. Reihenfolge der dargestellten Eigenschaften ents

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.I.2.1 G+C-Gehalt Mit 66.3 % besitzt R. eutropha einen verhältnismäßig hohen G+C-Gehalt, der sich zwi-schen Chr.1 (66.5 %) und

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Abb. 3.10: Kumulative GC-Skew-Analyse von Chr.1 aus R. eutropha nach Grigoriev (1998). Ähnlich wie R. solanacearum besitzt R.

ERGEBNISSE KAPITEL 3 der DNA-Gyrase B (EC 5.99.1.3; H16_A0003) und drei Untereinheiten eines Typ I Re-striktions-Modifikationssystems (H16_A0004-0006

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.I.2.3 RNA-Gene Mit dem Programm tRNAscanSE wurden im Genom von R. eutropha insgesamt 59 tRNAs identifiziert (siehe 2.13.2), 51

ERGEBNISSE KAPITEL 3 wurde bereits für eine Reihe eukaryotischer und prokaryotischer Organismen beschrie-ben (Ralph & McClelland, 1993; Miller et

ERGEBNISSE KAPITEL 3 gleichzeitig wird die Vorhersage der START-Codons und damit die Längenbe-stimmung aller kodierenden Sequenzen erschwert. 2. Als

ERGEBNISSE KAPITEL 3 führt (siehe 2.13.3). Diese Annotation bildet die Grundlage der in dieser Arbeit durch-geführten Sequenzanalysen. 3.I.3 Mosaiks

INHALTSVERZEICHNIS 4.I.2 Charakterisierung von Chromosom 2 aus R. eutropha H16... 121 4.I.3 Genomorganisation in R. eutropha

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Bei diesen Vergleichen zeichneten sich starke Übereinstimmungen von Chr.1 aus R. eutropha und dem Chromosom aus R. solanacearum

ERGEBNISSE KAPITEL 3 konservierte Anordnung der Gene im Genom erstreckt sich über die gesamten Chromo-somen und wird nur an Replikationsursprung und

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.I.3.2 Vorhersage genomischer Inseln Als genomische Inseln werden DNA-Bereiche bezeichnet, die aufgrund ihrer Zusam-mensetzung

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Sequenzen innerhalb potentieller Genominseln wird zudem durch zwei weitere Proble-me erschwert: 1. Die von ihrer Umgebung abwei

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.I.4 Charakterisierung von Chromosom 2 Der hohe Grad an Übereinstimmung zwischen den beiden größten Replikons aus R. eutropha u

ERGEBNISSE KAPITEL 3 lokalisiert. Außerhalb von cbbc enthält Chr.2 ein weiteres, verkürztes cbbR-Gen (H16_B1429), dessen potentiellem Produkt das im

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Tab. 3.3: Gen-Cluster für potentielle Formiat-Dehydrogenasen auf Chr.2. Nr CDS Annotation 1 H16_B1702 oxalate:formate antiport

ERGEBNISSE KAPITEL 3 für Gluconat (Blackkolb & Schlegel, 1968) und 2-Ketogluconat (Nandadasa et al., 1974) gefunden. Der Abbau beider Substrate e

ERGEBNISSE KAPITEL 3 β-D-Glucose-6-PhosphatD-Glucono-1,5-Lacton-6-Phosphat6-Phosphogluconat2-Keto-3-Desoxy-6-Phospho-Gluconatβ-D-Glucoseβ-D-Fructose-

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Was den Enzymapparat des ED-Weges in R. eutropha angeht, so ist eine klare Zuord-nung verschiedener Bereiche zu den beiden große

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Abkürzungsverzeichnis A Adenin Abb. Abbildung ABC ATP-binding cassette Ala Alanin Amp Ampicillin APS Ammoniump

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Cluster 2 (Tab. 3.5) kodiert für eine potentielle Glucokinase (H16_B2564), eine weitere Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (H16_B2

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Cluster 5 auf Chr.1 (Tab. 3.8) kodiert für eine zweite Gluconat-Permease (H16_A3011). In diesem Cluster ist außerdem eine von zw

ERGEBNISSE KAPITEL 3 ebene zu einer Domäne auf, die als Bordetella uptake gene product beschrieben wurde (pfam03401, Bug). Dabei handelt es sich wahr

ERGEBNISSE KAPITEL 3 werden 1,2-disubstituierte, nicht-substituierte und viele monosubstituierte Aro-maten über Catechol abgebaut, 1,3- und 1,4-disub

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Tab. 3.10: Abbau aromatischer Kohlenwasserstoffe, CDSs auf Chr.1. Nr. CDS Gen Annotation EC-Nummer 1. Abbau von Benzoat und D

ERGEBNISSE KAPITEL 3 bb. 3.18: Schematische Darstellung des Abbaus aromatischer Kohlenwasserstoffe in R. eutropha über den β-Ketoadipat-Weg nach KEG

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Der vollständige Abbau von Phenol über Catechol zu Pyruvat und Acetyl-CoA durchTab. 3.12: Abbau aromatischer Kohlenwasserstoffe

ERGEBNISSE KAPITEL 3 PhenolDmpKLMNOPEC 1.14.13.7P0: H16_B0539 P3: H16_B0542P1: H16_B0540 P4: H16_B0543P2: H16_B0541 P5: H16_B0544Catechol2-Hydroxy

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Diejenigen Cluster, die auf Basis der Sequenzdaten nicht zuverlässig annotiert werden können bzw. unvollständig vorliegen, kodie

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.I.4.2.2 Erschließung alternativer Stickstoff-Quellen 3.I.4.2.2.1 Cyanat-Hydratase Das cynTSX-Operon ermöglicht es Escherichia

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig E. Escherichia EDTA ethylene diamine tet

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Auch für R. eutropha wurde die Fähigkeit nachgewiesen, Formamid als Stick-stoffquelle über die Aktivität einer Formamidase zu nu

ERGEBNISSE KAPITEL 3 3.I.4.2.3 Alternative Phosphorquellen Eine Reihe Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien ist in der Lage, Phosphonate abzuba

ERGEBNISSE KAPITEL 3 In Klebsiella pneumoniae wurden sechs Gene identifiziert, die an der Synthese von PQQ beteiligt sind (Meulenberg et al., 1992);

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Das kdpABC-Operon kodiert für einen Enzymkomplex aus der Familie der P-Typ-ATPasen, deren Mitglieder für den Membrantransport vi

ERGEBNISSE KAPITEL 3 Tab. 3.15: Flagellarapparat, verschiedene Gen-Cluster auf Chr.2. Nr. CDS Gen Annotation 1 H16_B0252 flhB flagellar biosyntheti

ERGEBNISSE KAPITEL 3 chungen zwischen beiden Spezies konnten nur innerhalb des flg-Operons und dort be-sonders in Bezug auf flgN festgestellt werden:

ERGEBNISSE KAPITEL 3 entscheidenden Einfluß auf die Spezifität und Reihenfolge der verknüpften Peptide (Stein et al., 1996). 1 2 35 7 8 9 10 11 126

ERGEBNISSE KAPITEL 3 In R. eutropha ist eine potentielle NRPS in einem ca. 36 kbp großen Operon aus 14 Genen auf Chr.2 kodiert (Tab. 3.16; Abb. 3.20)

ERGEBNISSE KAPITEL 3 zifische Sekretionssysteme abgegeben und bilden Poren in eukaryotischen Zellen, die auf diesem Weg lysiert werden. Bei dem bestu

ERGEBNISSE KAPITEL 3 rtx-Operons kodiert – eine Organisationsform, die bisher nur für Bordetella pertussis beschrieben wurde (Laoide & Ullmann, 1